Ce tableau mural, exécuté à l’aide d’une technique peu durable – la peinture à la détrempe -  a présenté dès le 16e siècle les premiers signes d’altération que d’incessants travaux de restauration n’ont pas encore réussi à stopper. L’œuvre n’a rien perdu de son effet impressionnant malgré le mauvais état du tableau. La dernière restauration a éliminé les repeints de la nature morte sur la nappe, rendant aux couleurs leurs nuances, leurs valeurs plastiques et leurs tons de clair-obscur.
Maintes fois recopiée, recréée et reproduite, cette œuvre est restée la variante la plus connue sur ce thème.

Comme les artistes florentins avant lui, Léonard a placé la Cène dans un espace théâtral construit d’après les règles de la perspective centrale. Les lignes de perspective se rejoignent dans l’œil droit du Christ, ce qui souligne à nouveau sa position centrale dans la composition et dans l’espace pictural. L’artiste se concentre sur l’instant où Jésus est assis à table avec ses disciples et va annoncer : « En vérité, je vous le dis, l’un de vous va me livrer. » ( Matth. 26 : 21 ). Presque tous les disciples expriment alors leur surprise et leur effroi par différents gestes et réactions : en bout de table, à gauche, Barthélémy, irrité, se lève de sa chaise ; à côté de lui, Jacques le Mineur et André lèvent, étonnés, les mains au ciel. Pierre se lève également de son siège et se tourne, le visage courroucé, vers le centre du tableau. Devant lui apparaît Judas, qui recule, effrayé, touchant de sa main droite la bourse contenant l’argent de sa trahison.

Pour la première fois dans l’histoire des représentations de la Cène après le Moyen Age, Judas n’est plus assis devant, mais derrière la table. Il est de ce fait, tout près de Jean, qui réagit avec retenue ( il ne connaît pas encore le traître ), regardant devant lui, méditatif, les mains jointes. Jésus lui-même, tout aussi impassible, occupe une position centrale au milieu de tableau et devant une fenêtre. Il est flanqué de l’autre côté par deux autres groupes composés chacun de trois disciples : Thomas, Jacques le Majeur, Philippe, ainsi que Matthieu, Thaddée et Simon.

A l’encontre de ses contemporains peintres, Léonard rend l’action dynamique aussi bien en répartissant les douze apôtres en quatre groupes différents, qu’en représentant de manière exactement calculée les gestes et ls mimiques de chaque personnage.
Des relevés, des idées esquissées et les dessins préliminaires pour la Cène, ainsi que quelques récits de témoins oculaires, documentent les efforts considérables que l’artiste a dû fournir pour obtenir de multiples effets particulièrement expressifs de gestes et mimiques. Ainsi, l’artiste a cherché à Milan et ses environs, des types de visages correspondant aux différents apôtres, et a même cherché des modèles appropriés pour les représentations des mains. Cette préparation minutieuse se lit dans les études intensives des physionomies de Jaques le Majeur, Judas et Philippe.
Sur le plan artistique, Léonard a même emprunté de nouvelles voies pour réaliser la composition, en répartissant les douze disciples en groupes de trois personnes, condensant l’atmosphère déjà chargée d’émotions.
Cette répartition en groupes ne se rattache pas uniquement aux efforts de Léonard pour dramatiser l’événement, mais aussi au lieu dans lequel se déroule La Cène.
Trois lunettes forment avec le tableau le haut du mur du réfectoire, et cette répartition influence aussi le rythme ternaire des groupes placés en dessous. Les apôtres, aux deux extrémités de la table, se trouvent en dessous des deux plus petits arcs, les deux groupes intérieurs et le Christ sont ensemble sous l’arc central. Les lunettes elles-mêmes comportent des ornements végétaux et héraldiques entourés d’armoiries, peintes a secco. Au milieu, se trouvent les armoiries de Ludovico Sforza, le maître d’ouvrage, associées à celles de sa femme Béatrice d’Este. A gauche, apparaissent les armoiries de Massimiliano, son premier-né et à sa droite, celles de Francesco, son fils cadet.
Si l’on songe que Ludovic avait fait transformer l’église attenante de San Maria delle Grazie en tombeau funéraire pour sa famille, La Cène de Léonard est à considérer non seulement comme un exemple artistique d’innovation et de force créative, mais aussi comme un document dynastique du maître d’ouvrage.